Subjects

Students will become familiar with basic biochemical methods. A method that has wide application in biochemistry is gel chromatography, students separate a protein from a mixture or determine the relative molecular mass of an unknown protein. Separation of proteins and determination of relative molecular mass is also performed by electrophoresis in polyacrylamide gel in the presence of SDS. Great attention is paid to the principles of working with enzymes: determination of specific enzyme activity, determination of enzyme affinity for the substrate, determination of maximum reaction rate, pH optimum, monitoring of the reaction time course and the influence of inhibitors and activators on the enzyme reaction. The presence of isoenzymes is demonstrated on the example of lactate dehydrogenase, which students separate in a polyacrylamide gel under native conditions and detect enzyme activity in the gel.
Odeslat zpětnou vazbu
Dostupné výsledky překladu

Last update: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.12.2024)

Studenti se seznámí se základními biochemickými metodami. Metodou, která má široké uplatnění v biochemii, je gelová chromatografie, studenti separují protein ze směsi nebo stanoví relativní molekulovou hmotnost neznámého proteinu. Separace proteinů a stanovení relativní molekulové hmotnosti se provádí rovněž elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Velká pozornost je věnována zásadám práce s enzymy: stanovení specifické aktivity enzymu, zjištění afinity enzymu k substrátu, stanovení maximální rychlosti reakce, pH optima, sledování časového průběhu reakce a vliv inhibitorů a aktivátorů na enzymovou reakci. Přítomnost izoenzymů je demonstrována na příkladu laktátdehydrogenasy, kterou studenti separují v polyakrylamidovém gelu za nativních podmínek a detekují enzymovou aktivitu v gelu.

Last update: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.12.2024)

Skripta ke stažení
Laboratorní cvičení z biochemie, editoři: Doc. RNDr. M. Kodíček, CSc. a Doc. RNDr. O. Valentová, CSc.; Praha 2000

Last update: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.01.2020)

Obecná pravidla hodnocení:

práce na úloze bude umožněna jen studentům, kteří prokážou dostatečné porozumění principům (na začátku každého praktikového dne jsou studenti prozkoušení ze své úlohy)
před odchodem je nutné nahlásit získané výsledky, bez ohlášení nebude výseldek uznán
práce v praktiku probíhají ve dvojici, ale protokoly odevzdává každý/á student/ka zvlášť
vytištěný protokol je třeba odevzdat nejpozdeji na začátku příštích praktik, jinak úloha propadá
doporučujeme protokol odevzdat elektronicky - pdf formát
vyučující ohodnotí protokol do týdne od odevzdání (vzhledem k tomu a případné opravě doporučujeme poslat protokol co nejdříve)
případná oprava protokolu je možná do 14 dnů od vykonání úlohy
vyučující může vyžadovat uvedení protokolu do akceptovatelného stavu do tří týdnů od provedení úlohy, jinak nebude výsledek uznán
v případě propadnutí úlohy musí student/ka splnit další úlohu navíc, termín je dohodnut s vyučujícím
absence nebo pozdní příchod musí být řádně omluven, při nedodržení musí student/ka splnit další úlohu navíc
k zápočtovému testu může scházet nejvýše jeden schválený protokol

Pro získání zápočtu je třeba:

(ve dvojici) přednést prezentaci vybrané úlohy
mít protokoly ke všem úlohám schváleny
napsat závěrečný test
získat alespoň 2/3 bodů z testu a protokolů celkem
vrátit klíč od skříňky na chodbě

Last update: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.01.2020)

1. Isolation of a protein - enzyme, determination of specific activity

2. Gel chromatography of proteins (separation, relative molecular mass determination)

3. SDS - polyacrylamide electrophoresis (determination of relative molecular mass of proteins)

4. Practical enzymology - kinetic characteristics, Michaelis constants, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition of enzymes, electrophoretic separation of isoenzymes and detection of the enzyme activity in gel

5. DNA manipulation (restriction analysis)

6. Oral presentation of one experiment

Last update: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (22.03.2016)

Studenti vypracují vždy jednu úlohu z následujících okruhů úloh:

1. Izolace proteinu s enzymovou aktivitou a stanovení specifické aktivity

2. Gelová chromatografie

3. Separace proteinů elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS a stanovení relativní molekulové hmotnosti těchto proteinů

4. Sledování afinity enzymu k substrátu - určení Michaelisovy konstanty a maximální rychlosti reakce

5 Určení pH optima, sledování vlivu inhibitorů a aktivátorů na aktivitu enzymu, časový průběh enzymové reakce, detekce enzymové aktivity v polyakrylamidovém gelu

6. Práce s DNA: Hledání pachatele trestného činu.

7. Ústní prezentace teorie a výsledků jedné úlohy.

Last update: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (22.03.2016)