Toto praktikum je určeno pro studenty II. ročníku bakalářského studia biochemie a chemie v přírodních vědách.
Praktikum zajišťují: Daniel Kavan, Veronika Hýsková, Josef Chmelík, Kateřina Bělonožníková a Jan Fiala
Studenti se seznámí se základními biochemickými metodami používanými při izolaci proteinů a nukleových kyselin. Provádí extrakci proteinů z přírodních materiálů, centrifugaci, vysolování, dialýzu, lyofilizaci... Další metodou, která má široké uplatnění v biochemii, je gelová chromatografie, studenti separují protein ze směsi nebo stanoví relativní molekulovou hmotnost neznámého proteinu. Separace proteinů a stanovení relativní molekulové hmotnosti se provádí rovněž elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Velká pozornost je věnována zásadám práce s enzymy: stanovení specifické aktivity enzymu, zjištění afinity enzymu k substrátu, stanovení maximální rychlosti reakce, pH optima, sledování časového průběhu reakce a vliv inhibitorů a aktivátorů na enzymovou reakci. Přítomnost izoenzymů je demonstrována na příkladu laktátdehydrogenasy, kterou studenti separují v polyakrylamidovém gelu za nativních podmínek a detekují enzymovou aktivitu v gelu. Součástí praktika jsou ústní závěrečné prezentace a diskuse týkající se dosažených výsledků.
Všechny úlohy jsou koncipovány tak, aby je bylo možno experimentálně provést a vyhodnotit v časové dotaci 6 (vyučovacích) hodin. V případě potřeby je pedagogický dozor ochoten věnovat se studentům i nad rámec rozvrhované dotace. Pro klidné provedení všech úloh je dobré si pro praktikum vyhradit dostatek času. Všechny paralelky praktika budou začínat v 8:30.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.01.2020)
Practical course in biochemistry is provided by Daniel Kavan, Veronika Hýsková, Josef Chmelík, Kateřina Bělonožníková and Jan Fiala
The students are dealing with basic biochemical methods used for protein and nucleic acid isolation and their characterization (extraction, centrifugation, precipitation, dialysis, protein content determination). Gel filtration is used for protein purification from a mixture or for relative molecular mass determination. The students determine the relative molecular mass of proteins by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Important part of the practical course is dealing with enzymes, determination of Michaelis constant, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition, electrophoretic separation of isoenzymes and their detection in gel.
All experiments are designed the way anyone should be able to carry them out in six (lecture) hours, the stuff will be ready to help students in some extra time, however. It is suggested to reserve enough time for the experiments. Each parallel group will start the work at 8:30.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.01.2020)
Literatura
Skripta ke stažení
Laboratorní cvičení z biochemie, editoři: Doc. RNDr. M. Kodíček, CSc. a Doc. RNDr. O. Valentová, CSc.; Praha 2000
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.01.2020)
Požadavky ke zkoušce
Obecná pravidla hodnocení:
práce na úloze bude umožněna jen studentům, kteří prokážou dostatečné porozumění principům (na začátku každého praktikového dne jsou studenti prozkoušení ze své úlohy)
před odchodem je nutné nahlásit získané výsledky, bez ohlášení nebude výseldek uznán
práce v praktiku probíhají ve dvojici, ale protokoly odevzdává každý/á student/ka zvlášť
vytištěný protokol je třeba odevzdat nejpozdeji na začátku příštích praktik, jinak úloha propadá
doporučujeme protokol odevzdat elektronicky - pdf formát
vyučující ohodnotí protokol do týdne od odevzdání (vzhledem k tomu a případné opravě doporučujeme poslat protokol co nejdříve)
případná oprava protokolu je možná do 14 dnů od vykonání úlohy
vyučující může vyžadovat uvedení protokolu do akceptovatelného stavu do tří týdnů od provedení úlohy, jinak nebude výsledek uznán
v případě propadnutí úlohy musí student/ka splnit další úlohu navíc, termín je dohodnut s vyučujícím
absence nebo pozdní příchod musí být řádně omluven, při nedodržení musí student/ka splnit další úlohu navíc
k zápočtovému testu může scházet nejvýše jeden schválený protokol
Pro získání zápočtu je třeba:
(ve dvojici) přednést prezentaci vybrané úlohy
mít protokoly ke všem úlohám schváleny
napsat závěrečný test
získat alespoň 2/3 bodů z testu a protokolů celkem
vrátit klíč od skříňky na chodbě
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (17.01.2020)
Sylabus -
Studenti vypracují vždy jednu úlohu z následujících okruhů úloh:
1. Izolace proteinu s enzymovou aktivitou a stanovení specifické aktivity
2. Gelová chromatografie
3. Separace proteinů elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS a stanovení relativní molekulové hmotnosti těchto proteinů
4. Sledování afinity enzymu k substrátu - určení Michaelisovy konstanty a maximální rychlosti reakce
5 Určení pH optima, sledování vlivu inhibitorů a aktivátorů na aktivitu enzymu, časový průběh enzymové reakce, detekce enzymové aktivity v polyakrylamidovém gelu
6. Práce s DNA: Hledání pachatele trestného činu.
7. Ústní prezentace teorie a výsledků jedné úlohy.
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (22.03.2016)
1. Isolation of a protein - enzyme, determination of specific activity
2. Gel chromatography of proteins (separation, relative molecular mass determination)
3. SDS - polyacrylamide electrophoresis (determination of relative molecular mass of proteins)
4. Practical enzymology - kinetic characteristics, Michaelis constants, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition of enzymes, electrophoretic separation of isoenzymes and detection of the enzyme activity in gel
5. DNA manipulation (restriction analysis)
6. Oral presentation of one experiment
Poslední úprava: Kavan Daniel, RNDr., Ph.D. (22.03.2016)
