PředmětyPředměty(verze: 953)
Předmět, akademický rok 2023/2024
   Přihlásit přes CAS
Genové inženýrství - MB140P36
Anglický název: Genetic Engineering
Český název: Genové inženýrství
Zajišťuje: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Fakulta: Přírodovědecká fakulta
Platnost: od 2019
Semestr: zimní
E-Kredity: 6
Způsob provedení zkoušky: zimní s.:kombinovaná
Rozsah, examinace: zimní s.:3/2, Z+Zk [HT]
Počet míst: neomezen
Minimální obsazenost: neomezen
4EU+: ne
Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
Stav předmětu: vyučován
Jazyk výuky: čeština
Úroveň: základní
Poznámka: povolen pro zápis po webu
Garant: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D.
Vyučující: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D.
Korekvizity : {Molekulární biologie (MB140P71, MB140P21 nebo MB140P41)}
Anotace -
V přednášce jsou popisovány jak základní tak i pokročilejší metody genově inženýrských přístupů a manipulací eukaryotických a prokaryotických organizmů. Přednáška je primárně zaměřena po popis principů a využití klasických genově inženýrských metod, jakožto nezbytného základu experimentální práce v laboratořích molekulárně biologického zaměření.
Mezi hlavní témata této přednášky patří izolace nukleových kyselin z odlišných typů buněk či tkání; chemická a biochemická syntéza nukleových kyselin včetně PCR a RT-PCR; degradace a modifikace DNA i RNA; využití restrikčních endonukleáz k přípravě rekombinantních molekul DNA; charakterizace a konstrukce rekombinantních vektorů; rekombinace DNA in vitro i in vivo; transformace různých typů buněk molekulami DNA i RNA; strategie selekce rekombinantních molekul, virů a buněk; místně specifické mutageneze a mutageneze in vivo; různé sekvenační postupy; konstrukce genomových a cDNA knihoven; strategie exprese cizorodých proteinů v různých expresních systémech; rozličné způsoby analýzy genové exprese; umlčování genů pomocí RNA interference; možnosti modifikace eukaryotických genomů in vivo a praktické využití genově inženýrských přístupů.
Metody a strategie jsou demonstrovány jak na in vitro systémech, tak i na systémech in vivo v bakteriích (E. coli) nižších eukaryotech (S. cerevisiae) a na tkáňových kulturách eukaryot vyšších.

Poslední úprava: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (24.08.2022)
Literatura -

·      Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press

·      J. Sambrook, D. Russell - Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition / Fourth Edition, CSHL Press)

·      Vondrejs V. (1997, 2001, 2003, 2011), Genové inženýrství I-IV, Karolinum

·      (V. Vondrejs; Otazníky kolem genového inženýrství, Academia 2010)

·      Brown T.A. (2006, 2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction; Blackwell Publishing Incorporated

·      T. Nicholl - An Introduction to Genetic Engineering, Third Edition (2008)

·      S.B. Primrose – Principle of gene manipulation and genomics, Seventh Ed. (2006)

·      různé firemní „aplikační“ manuály

·      různé firemní „TechNotes“

Prezentace k přednášce, které jsou přihlášeným studentům dostupné na http://web.natur.cuni.cz/~pospisek/vyuka/vyuka.htm, přístupový klíč je studentům sdělen vždy na začátku přednáškového cyklu.

Poslední úprava: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (28.08.2017)
Požadavky ke zkoušce -

Zkouška je obvykle písemná, znalosti vyžadované k jejímu úspěšnému složení vycházejí z probírané látky. Na položené otázky (celkem cca 10) je třeba vypsat odpověď, nejedná se tedy o prosté zaškrtávání odpovědí. Časový limit testu je 120 minut. Bodové hodnocení odpovědí vychází z náročnosti otázek (za jednotlivé otázky lze obvykle získat 5-3-3-2-2-2-1-1-1 bod, celkem tedy 20 bodů). Klasifikace je následující: 18-20 bodů = výborně; 15-17,5 bodu = velmi dobře; 12-14,5 bodu = dobře; méně než 12 bodů = neprospěl/a.

Poslední úprava: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (28.08.2017)
Sylabus -

1.         Stručný úvod do Genového inženýrství; historické milníky, modelové organismy využívané v GI, výhody/nevýhody jejich využití; porovnání klasických a netradičních genetických metod. Základní sled kroků pro umělý přenos genetické informace mezi buňkami pomocí metod GI a možnosti úniku z tohoto sledu.

2.         Metody izolace nukleových kyselin z virů, organel a buněk; principy a přístupy s ohledem na vstupní materiál a následné využití nukleových kyselin. Přečistění nukleových kyselin. Izolace plazmidové DNA.

3.         Principy separace NK; základy elektroforetických, centrifugačních a separačních technik, stanovení koncentrace a čistoty NK, principy separace proteinů. Chemická syntéza nukleových kyselin.

4.         Syntéza NK;  termolabilní polymerázy (posun přerušení, metoda náhodných primerů), Polymerázová řetězová reakce (historie, princip, fáze a průběh, složky PCR směsi, aditiva, problémy spojené s PCR).

5.         PCR; varianty PCR (RACE, asymetrické PCR, in situ PCR, značení DNA pomocí PCR, multiplex PCR, mutagenní PCR, hot start PCR apod.), PCR s degenerovanými primery. Přepis RNA do cDNA (reverzní transkripce), různé varianty kvantitativního PCR (RQ-PCR), RACE-PCR. Metody fragmentace DNA - mechanická degradace (střižné napětí, ultrazvuk), enzymatická fragmentace DNA (sekvenčně nespecifická fragmentace nukleových kyselin)

6.         Sekvenčně specifické degradace nukleových kyselin; restrikční endonukleázy (RE), restrikčně-modifikační systémy I-III, detailní popis RM systému II (klasifikace RE podle způsobu štěpení, rozeznávané palindromatické sekvence, typy konců generovaných RE a jejich využití při klonování, podmínky a problémy restrikčního štěpení, zastavení účinku RE, distribuce velikosti fragmentů).

7.         Enzymy pro syntézu, modifikaci, spojování a úpravy konců DNA; aktivity, využití, výhody a nevýhody vybraných enzymů (např. Klenowův fragment DNA polymerázy I, T4 DNA polymeráza, Mung-Bean, Bal 31), kinázy, alkalické fosfatázy apod.). Využití polylinkerů a spacerů při klonování a úpravě nukleových kyselin. Radioaktivní a neradioaktivní značení nukleových kyselin, příprava sond, Southern blot, detekce.

8.         Rekombinace fragmentů s vektorem in vitro;  vektory rozdělení; vektory plasmidového typu; fagemidy, vektory odvozené od fága lambda (substituční, inserční), kosmidy, P1 vektory, PAC, BAC, YAC vektory. Ligázy, klonování kohezních a tupých konců.

9.         Klonování genů; klonováni PCR fragmentů, klonování nezávislé na ligaci (LIC), GATEWAY systém, detekce rekombinantních klonů. Vnášení nukleových kyselin do organismů - transformace bakterií; transformace savčích a rostlinných buněk, stabilní a transientní transformace, Flp-In systém přípravy stabilních linií.

10.     Mutageneze; chemické mutageny; vnášení mutací do NK pomocí enzymatických reakcí, oligonukleotidem řízena mutageneze, mutageneze pomocí PCR. Sekvenování DNA – metoda chemického štěpení, metoda terminace řetězce. Transkripce in vitro transkripce.

11.     Exprese cizorodých proteinů;  charakterizace expresních systémů; expresní systém odvozený od E. coli (výhody a nevýhody exprese v E. coli, expresní vektory se zaměřením na výběr vhodného promotoru, expresní kazety, možnosti izolace rekombinačních proteinů z buněk, optimalizace produkce obtížně se exprimujících proteinů). Translace in vitro. Významné laboratorní kmeny E. coli.

12.   Genové inženýrství u eukaryot se zaměřením na kvasinku S. cerevisiae;stručný popis modelového systému S. cerevisiae (kmeny, využití podvojných vektorů, integrativní vektory, příprava knock-out kmenů, kvasinkové expresní systémy, cílená mutageneze in vitro). Expresní systémy založené na bakulovirových vektorech a tkáňových liniích, příprava genomových a cDNA knihoven.

13.   Genové inženýrství vyšších eukaryot; analýza genové exprese (primer extension, northern blot, microarray, SAGE, Phage display, dvouhybridové systémy, footprinting, gel retardation assay); RNA interference, modifikace genomů (TALEN, Zinc-finger nucleases, CRISP/Cas9), genová terapie.

Poslední úprava: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (28.08.2017)
 
Univerzita Karlova | Informační systém UK