The class reviews current methods used in molecular and cellular biology. The topics cover a broad spectrum of methods from genome editing methods, nucleic acids sequencing and manipulation, protein detection and identification, use of fluorescent probes and proteins to modern microscopic techniques. Basic understanding of molecular and cellular biology and genetic engeneering is required.
Last update: RNDr. Michal Čáp, Ph.D. (15.02.2022)
Pro akademický rok 2021/2022:
přednášky budou probíhat prezenčně podle rozvrhu. Prezentace, odkazy na přednášky a další materiály budou k dispozici na Moodle https://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=283
heslo pro vstup je: metodymb
Přednáška nabízí přehled širokého spektra laboratorních metod používaných v současné molekulární a buněčné biologii. Předpokládají se základní znalosti molekulární biologie, biologie buňky a genového inženýrství.
Literature -
Last update: RNDr. Michal Čáp, Ph.D. (23.10.2019)
The presentations from class and recomended literature sources are aviable in Moodle 2 (Moodle UK pro výuku 2\Přírodovědecká fakulta\sekce Biologie\Katedra genetiky a mikrobiologie\Metody v molekulární a buněčné biologii). Password is provided on the first lesson or upon request of the teacher.
Last update: RNDr. Michal Čáp, Ph.D. (20.03.2017)
Předmět má přiřazen stejnojmenný kurz v systému Moodle 2(Moodle UK pro výuku 2\Přírodovědecká fakulta\sekce Biologie\Katedra genetiky a mikrobiologie\Metody v molekulární a buněčné biologii). Klíč vyžadovaný k přihlášení je sdělen na přednášce. K dispozici jsou zde prezentace z přednášek a případná doporučená literatura.
Requirements to the exam -
Last update: RNDr. Michal Čáp, Ph.D. (23.10.2019)
The course is accomplished by examination in written form. The test consist of 20 questions. Each question is evaluated with 0-2 points.
grading:
34-40 ...1 27-33 ...2 >20-26 ...3 <=20 ... 4
Last update: RNDr. Michal Čáp, Ph.D. (20.03.2017)
Zkouška se skládá formou písemného testu. Čas na vypracování je 60 minut. Obsahuje dvacet otázek ke stručnému vyplnění. Jedna otázka je hodnocena 0-2 body.
Genome manipulations and reverse genetics
Selection and reporter genes, tools for genome manipulation (site-specific recombinases, site-specific endonucleases, homologous recombination)
reverse genetics - random gene inactivation (transposon mutagenesis, TILLING, gene trap), targeted gene inactivation (knock-out, RNA-interference), regulated gene expression.
Genomic modifications in model organisms
Characteristics and specifics of model organisms of molecular biology (E. coli, S. cerevisia, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, mouse, human - tissue culture), creation of knock-out, conditional knock-out, knock-in, transformation methods, vectors.
Human gene modifications - gene therapy
In vivo and ex vivo gene therapy, stem cells, cloning, induced pluripotent cells, viral vectors for gene therapy (retroviral, adenoviral, AAV), their production, non-viral vectors (transposon), transfection methods, polymer carrier DNA design, gene therapy approaches (expression of functional allele of gene, expression of suicide gene, decrease of gene expression, repair of damaged gene), antisense therapy.
DNA sequencing
Chronological view of sequencing methods (chemical degradation method, dideoxy method, pyrosequencing, second generation methods (454, Illumina, Ion Torrent), third generation methods (PacBio), de novo vs. re-sequencing, exome sequencing, genome sequencing, genomic projects .
Methods of gene expression studies
Methods of study of individual gene expression: EST, Northern blot, qRT-PCR (PCR kinetics, Ct value, probes for detection, normalization, PCR efficiency).
Methods of study of transcriptome: DNA chips (principle, presentation of results: temperature maps, clustering; particular areas of use of DNA chips), RNA sequencing (RNA-Seq).
Protein study methods
Protein concentration determination, separation: PAGE (denaturing, native), staining, protein isolation and purification using affinity tags, immunolabeling-antibodies (primary, secondary, detection, production), immunoprecipitation,
Western blot, ELISA, methods of determination of protein-protein interactions at the level of individual proteins (pull-down assay, proximity ligation assay) and whole proteome (coimmunoprecipulation, TAP, 2-hybrid system, complement assay, phage display), degron, protein arrays ( analytical vs. functional chip).
Proteomics
mass spectrometry: separation, ionization techniques, types of analyzers, tandem MS.
Fluorescence and fluorescent labeling
Fundamentals of fluorescence, filters and light sources, fluorescent labeling of cells and organelles, use of fluorescent probes, fluorescent probes for measuring intracellular pH, ion concentration, membrane potential.
Fluorescence microscope, confocal microscope and two-photon confocal microscope. Green fluorescent protein (GFP) and its variants. Possibilities of using fluorescent proteins, FRET, FRAP, FLIM.
Flow cytometry.
flow cytometer and cell sorter, principle of measurement, dot plot, population gateway, multicolour flow cytometry, mass cytometry.
Advanced microscopic techniques
Atomic force microscopy, near field microscopy, TIRM, high resolution fluorescence microscopy (4Pi, STED, PALM / STORM).
Methods of the future
Third-generation DNA sequencing (nanopore sequencing and other techniques developed), single-cell techniques (laser micropreparation, optical tweezers, magnetic tweezers), DNA origami and DNA nanoarray, lab-on-chip microfluidic chips.
Last update: RNDr. Michal Čáp, Ph.D. (20.03.2017)
Genomové manipulace a reverzní genetika Selekční a reportérové geny, nástroje pro manipulaci s genomem (místně specifické rekombinázy, místně specifické endonukleázy, homologní rekombinace) reverzní genetika - náhodná inaktivace genu (transpozonová mutageneze, TILLING, genová past), cílená inaktivace genu (knock-out, RNA-interference), regulovaná exprese genu.
Genomové modifikace u modelových organizmů Charakteristika a specifika modelových organismů molekulární biologie (E. coli, S. cerevisie, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, myš, člověk - tkáňové kultury), vytváření knock-outů, podmíněných knock-outů, knock-inů, metody transformace, vektory.
Genové modifikace člověka - genová terapie In vivo a ex vivo genová terapie, kmenové buňky, klonování, indukované pluripotentní buňky, virové vektory pro genovou terapii (retrovirové, adenovirové, AAV), jejich produkce, nevirové vektory (transpozonové), metody transfekce, design polymerních nosičů DNA, přístupy genové terapie (exprese funkční alely genu, exprese sebevražedného genu, snížení exprese genu, oprava poškozeného genu), antisense terapie.
Sekvenace DNA Chronologický pohled na sekvenační metody (metoda chemické degradace, dideoxy metoda, pyrosekvenování, metody druhé generace (454, Illumina, Ion Torrent),metody třetí generace (PacBio), sekvenace de novo vs. resekvenace, sekvenace exomu, postup sekvenace genomů, genomové projekty.
Metody studia genové exprese Metody studia exprese jednotlivých genů: EST, Northern blot, qRT-PCR (kinetika PCR, hodnota Ct, sondy pro detekci, normalizace, efektivita PCR). Metody studia transkriptomu: DNA čipy (princip, prezentace výsledků: teplotní mapy, clusterování; dlaší oblasti použití DNA čipů), sekvenace RNA (RNA-Seq).
Metody studia proteinů Stanovení koncentrace proteinů, separace: PAGE (denaturační, nativní), barvení, Izolace a purifikace proteinů s využitím afinitních tagů, imunoznačení-protilátky (primární, sekundární, způsoby detekce, výroba), imunoprecipitace, Western blot, ELISA, metody stanovení protein-proteinových interakcí na úrovni jednotlivých proteinů (pull-down assay, proximity ligation assay) i celého proteomu (koimunoprecipirace, TAP, 2-hybridový systém, komplementační assay, phage display), degron, protein arrays (analytický vs. funkční čip).
Proteomika hmotnostní spektrometrie: separace, ionizační techniky, typy analyzátorů, tandemová MS.
Fluorescence a fluorescenční značení Základy fluorescence, filtry a zdroje světla, fluorescenční značení buněk a organel, použití fluorescenčních sond, fluorescenční sondy pro měření vnitrobuněčného pH, koncentrace iontů, membránového potenciálu. Fluorescenční mikroskop, konfokální mikroskop a dvoufotonový konfokální mikroskop. Zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty. Možnosti využití fluorescenční proteinů, FRET, FRAP,FLIM.
Pokročilé mikroskopické techniky Atomic force microscopy, mikroskopie blízkého pole, TIRM, fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením (4Pi, STED, PALM/STORM).
Metody budoucnosti Sekvenace DNA třetí generace (sekvenace nanopórem a další vyvíjené techniky), single-cell techniky (laserová mikropreparace, optická pinzeta, magnetická pinzeta), DNA origami a DNA nanoarray, lab-on-chip - mikrofluidní čipy.
