A practical course of molecular biology methods most common in molecular biology laboratories e.g. construction of recombinant plasmid, isolation and restriction mapping of unknown plasmid, polymerase chain reaction, analysis of nucleic acids in yeast and so on. Introduction to the principles of these methods. A part of this course is dedicated to the training of working rules and skills during the work with potential human pathogens in the the laboratory of biosafety level 2 (BSL-2).
References
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Last update: Mašek Tomáš, RNDr., Ph.D. (15.12.2012)
Pokud se nic zásadního nestane, praktikum z Molekulární genetiky (B140C39, 14 dní turnus) se v roce 2023/2024 bude konat od pondělí 26. 2. 2024 do pátku 8. 3. 2024.
Hlavním cílem tohoto kursu je seznámit studenty zejména 2. (či 3.) ročníku s metodami molekulární biologie s ohledem na možné využití těchto metod v laboratorní praxi studentů a se zřetelem na objasnění principů prováděných metod. V kursu se provádějí jak základní techniky molekulární biologie (např. izolace nukleových kyselin a proteinů), tak metody pokročilé (RT-PCR, RQ-PCR, STR analýza, klonování, produkce rekombinantních proteinů, luminiscenční techniky).
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (18.01.2024)
Literature -
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Sambrook J., Russell D.W., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Vondrejs V. (1997, 2001, 2003), Genové inženýrství I-III, Karolinum
Brown T.A. (2006) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction; Blackwell Publishing Incorporated
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (12.04.2012)
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Sambrook J., Russell D.W., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Vondrejs V. (1997, 2001, 2003), Genové inženýrství I-III, Karolinum
Brown T.A. (2006) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction; Blackwell Publishing Incorporated
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (24.08.2017)
Requirements to the exam -
Requirements to the exam are as follows:
1/ active participation in the practical course (one half-day absence is allowed during the whole course) 2/ elaboration of complete protocols (including theoretical parts)
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (25.10.2019)
Podmínky pro udělení zápočtu jsou následující:
1/ aktivní účast na praktiku (je povolena jedna půldenní absence během celého turnusového praktika)
2/ vypracování kompletních protokolů (včetně teoretických úloh), a jejich následné uznání vedoucím praktika
3/ výstupní test, který se skládá z cca 10-15 otázek týkajících se látky přednášené na praktiku. Časovým limit výstupního testu je 120 minut, minimální hranicí nutnou ke klasifikaci testu jako splněného je 60% správných odpovědí.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (18.01.2024)
Syllabus -
Please note, that the practical course is given in Czech language only.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (25.10.2019)
Úlohy řešené v průběhu praktik:
1. Konstrukce bakteriálního expresního vektoru, produkce a purifikace GFP. Jedná se o jednu z nosných úloh praktika, v jejímž průběhu si studenti osvojí základní postupy molekulárně biologické praxe jako je PCR, restrikční štěpení, agarózová elektroforéza, izolace DNA z gelu, ligace, různé typy transformace transformace bakterií, neradioaktivní hybridizace pomocí digoxigeninem značené sondy, minipreparace bakteriální plasmidové DNA, produkce rekombinantních proteinů v bakteriálním expresním systému a sledování fluorescence zeleného fluorescenčního proteinu in vivo.
2. Izolace plasmidové DNA a její sekvenace. Jedna z klasických metod molekulární biologie; účastníci praktika vyizolují pomocí tzv. alkalické metody bakteriální plasmidovou DNA, tuto přečistí a následně osekvenují metodou terminace řetězce (tzv. Sangerovo sekvenování). Výslednou sekvenci studenti anotují pomocí molekulárně biologických databází.
3. Izolace proteinů pomocí afinitní chromatografie. V této úloze se studenti naučí produkovat cizorodé proteiny v bakteriálním expresním systému a tyto proteiny následně purifikovat, detekovat a ověřovat jejich funkčnost či aktivity. Součástí této úlohy příprava bakteriálních lyzátů, proteinová elektroforéza v SDS gelech, izolace proteinů pomocí afinitních chromatografií, imunodetekce izolovaných proteinů na pevném nosiči (tj. western blot) a ověření funkčnosti afinitně purifikovaných proteinů pomocí enzymatických přístupů.
4. Práce s reportérovými geny u kvasinek; v průběhu této úlohy se posluchači naučí práci s kvasinkovými kulturami (transformace kvasinek, testování auxotrofií), včetně stanovení normalizované aktivity luciferázy a betagalaktosidázy v kvasinkových lyzátech pomocí luminiscenčních přístupů.
5. Analýza nukleových kyselin; úloha zahrnující několik různých postupů využívaných při izolaci DNA a RNA z kvasinek (izolace chromozomální a plasmidové DNA) a rostlin (izolace celkové RNA včetně následné reverzní transkripce (RT-PCR)).
6. Forenzní analýza DNA; izolace lidské DNA z bukálních výtěrů, určení krevních skupin a STR profilů účastníků praktika včetně následného statistické hodnocení.
7. Fúzní PCR, účastníci tohoto praktického kurzu si vyzkouší jednu z komplikovanější strategií PCR, takzvané fúzní (slučovací) PCR s využitím dvou nezávislých templátových molekul.
8. Stanovení exprese genů s využitím kvantitativního PCR (RQ-PCR); v této úloze budou studenti, pomocí absolutní kvantifikace, stanovovat počet kopií lidského genu naklonovaného v plazmidu, včetně následného statistického vyhodnocení.
9. Teoretické úlohy; průběžně v průběhu praktika (bioinformatika, práce s databázemi, navrhování primerů, vyhledávání genů, výukové molekulárně biologické programy, dvouhybridní systémy, anotace neznámé sekvence in silico apod.).
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (24.08.2017)
