Exploring Bacterial Regulatory RNAs for RNA Antibiotics Development

• Thesis title in Czech: Výzkum bakteriálních regulačních RNA pro vývoj RNA antibiotik
• Thesis title in English: Exploring Bacterial Regulatory RNAs for RNA Antibiotics Development
• Key words: transkripce, regulační RNA, sRNA, aktinobakterie, mykobakterie, RNA polymeráza, sigma faktor, genová exprese, rifampicin, antibiotika
• English key words: transcription, regulatory RNA, sRNA, actinobacteria, mycobacteria, RNA polymerase, sigma factor, gene expression, rifampicin, antibiotics
• Academic year of topic announcement: 2024/2025
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: Mgr. Jarmila Hnilicová, Ph.D.
• Author: hidden - assigned and confirmed by the Study Dept.
• Date of registration: 10.10.2024
• Date of assignment: 10.10.2024
• Confirmed by Study dept. on: 11.10.2024

Preliminary scope of work

Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) není regulována pouze sigma faktory nebo specifickými transkripčními faktory, ale také nekódujícími regulačními RNA. Nedávno jsme optimalizovali protokol pro nativní RIP-seq (imunoprecipitace RNA a sekvenování nové generace), abychom našli RNA, které se vážou na RNAP a primární sigma faktory v různých druzích bakterií. Naším cílem je zjistit, zda by tyto RNA mohly být upraveny tak, aby se pevně vázaly na RNAP a fungovaly jako inhibitory RNAP. Navrhujeme, že modifikované nukleové kyseliny na bázi těchto RNA by v budoucnu mohly být použity jako druhově specifická RNA antibiotika nebo jako molekuly schopné měnit složení mikrobioty.
Student bude testovat, jak je vazba jednotlivých RNA na bakteriální RNAP specifická, zejména bude porovnávat RNAP a RNA z různých druhů bakterií. Následně budou tyto RNA modifikovány tak, aby se pevně vázaly na cílové RNAP molekuly a potenciálně sloužily jako inhibitory bakteriálních RNA polymeráz. Dále se student bude podílet na charakterizaci funkcí nově identifikovaných RNA, které se váží na RNAP. Vazba RNA na RNAP bude stanovena jak in vivo, tak in vitro metodami. RNA budou přepisovány in vivo z inducibilních promotorů a jejich interakce s RNAP budou měřeny pomocí RNA imunoprecipitace nebo ultracentrifugace v glycerolových gradientech. Student rovněž určí vliv těchto RNA na genovou expresi pomocí RT-qPCR nebo RNA-seq. Kromě toho budou RNA přepsány in vitro pomocí T7 RNA polymerázy. Interakce RNA s jednotlivými RNA polymerázami, které budou purifikovány z různých druhů bakterií, budou stanoveny pomocí elektroforetic mobility shift assay (EMSA).

Preliminary scope of work in English

Bacterial RNA polymerase (RNAP) is regulated not only by sigma factors or specific transcription factors, but also by noncoding regulatory RNAs. Recently, we have established a native RIP-seq (RNA immunoprecipitation and next-generation sequencing) protocol to detect RNAs that associate with the RNAP and the primary sigma factors in various bacterial species. Our goal is to determine whether these RNAs could be engineered to tightly bind and sequester RNAPs and act as RNAP inhibitors. We propose that modified nucleic acid molecules based on these RNAs might be used in the future as species-specific RNA antibiotics; or as molecules capable of modifying the composition of microbiota.
The student will test the species specificity of individual RNAs that associate with RNAP. Then, RNAP-interacting RNAs will be modified to tightly bind the target RNAP and potentially serve as RNAP inhibitors. Further, the student will also participate in describing the function(s) of newly identified RNAP-associated RNAs. The association of RNAs with RNAP will be determined both by in vivo and in vitro methods. The RNAs will be expressed in vivo from inducible promoters, and their interactions with RNAP measured by RNA immunoprecipitation or glycerol gradient ultracentrifugation. The student will also determine the effect of these RNAs on gene expression by RT-qPCR or RNA-seq. Additionally, RNAs will be transcribed in vitro by T7 RNA polymerase, and RNAPs will be purified from individual bacterial species. The interaction of RNAs with individual RNA polymerases will be determined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA).