Charakterizace transkripčních komplexů kvasinkových VLE in vitro a in vivo

• Thesis title in Czech: Charakterizace transkripčních komplexů kvasinkových VLE in vitro a in vivo
• Thesis title in English: Characterization of yeast VLE transcription complexes in vitro and in vivo
• Key words: VLE, lineární plasmidy, transkripce, dvouhybridový systém, mikroskopie, lokalizace
• English key words: VLE, linear plasmids, transcription, two-hybrid system, microscopy, localization
• Academic year of topic announcement: 2023/2024
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: Mgr. Václav Vopálenský, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 05.10.2023
• Date of assignment: 05.10.2023

Preliminary scope of work

Náplň této disertační práce, pod výše uvedeným shrnujícím názvem, lze rozdělit do dvou úzce souvisejících a vzájemně se doplňujících témat. Obě témata se úzce dotýkají transkripčního aparátu cytoplasmaticky lokalizovaných lineárních kvasinkových plasmidů s prototypovými plasmidy pGKL1 a pGKL2 vyskytujících se v kvasince Kluyveromyces lactis. Tyto plasmidy jsou díky své podobnosti se zástupci čeledi Poxviridae nyní souhrnně označovány jako VLE (virům podobné elementy, virus like elements) a představují unikátní možnost, právě díky této podobnosti, přenést minimálně část výzkumu z infekčního virového systému do kvasinkového neinfekčního systému. Prvním z plánovaných témat navazuje na projekt dlouhodobě běžící v Laboratoři biochemie RNA, a to konkrétně podrobná charakterizace transkripčního aparátu (TA) lineárních plasmidů s jeho následným sestavením in vitro. V současné době máme ověřeno, které proteiny tvořící TA spolu interagují in vivo, nicméně není zcela zřejmé, zda pro sestavení aktivního holoenzymu RNA polymerázy nejsou potřebné další interakční partneři, ať již jde o proteiny kódované plasmidy se zatím neznámou funkcí či dokonce proteiny kódované hostitelskou buňkou. Nejsou také známé konkrétní aminokyseliny zúčastněných proteinů zodpovědné za protein-proteinové interakce. Proto plánujeme využít kvasinkový dvouhybridový systém pro ověření interakce plasmidových proteinů se zatím neznámou funkcí (máme k dispozici jejich genově optimalizovanou verzi) se známými proteiny tvořícími TA, pro hledání případných interakčních partnerů proteinů tvořících TA v kvasinkové expresní cDNA knihovně (opět máme k dispozici) a v neposlední řadě pro zjištění přesných míst interakce proteinů TA pomocí přístupu „Absence of Interference“ (Dhayalan et al., 2007; DOI: 10.1016/j.jmb.2007.12.032). Druhé z plánovaných témat je zcela nové a využije bohatou paletu v naší laboratoři připravených a ověřených modifikovaných lineárních pGKL plasmidů. Máme k dispozici zhruba 30 variant modifikovaných plasmidů (některé viz Sýkora et al, 2018; DOI: 10.1371/journal.ppat.1007377) obsahující různými tagy označené proteiny TA, ale i další proteiny kódované lineárními plasmidy. Jelikož o povaze cytoplasmatické lokalizace lineárních plasmidů není vůbec nic známo, plánujeme využít tyto označené proteiny k mikroskopickému stanovení lokalizace TA v buňce. Dle předběžných výsledků se zdá, že minimálně část proteinů tvořící TA je asociována s membránami či dokonce tvoří uskupení podobná tzv. virovým továrnám (viral factories).
Projekt bude financován projektem EXCELES (NIVB) či z jiných zdrojů naší laboratoře.