Cílem této doktorské práce je zlepšit vědecké poznání v oblasti výzkumu tzv. komplexu WASH (WASH complex), pentamerního vnitrobuněčného komplexu z rodiny WASP, který reguluje aktivitu Arp2/3 komplexu. WASH je unikátní mezi členy superrodiny WASP v tom, že lokalizuje na endozomální povrch a reguluje tam polymeraci aktinu. U linií s knock-outovaným genem pro WASH zcela chybí F-aktin na membráně. V rámci své práce se soustředím na několik aspektů komplexu WASH, včetně: 1) podjednotky FAM21 a významu jejích tzv. LFa motivů při vazbě interakčních partnerů, 2) způsobu, jakým WASH komplex nasedá na endozomální membránu, a role retromeru v tomto procesu, 3) funkce dodnes neprozkoumaných podjednotek SWIP a strumpellin a jejich interakční síť a 4) význam dalších nedávno vybraných kandidátů na interakční partnery komplexu WASH. Práce bude prováděna v lidských buněčných liniích (U2OS, HeLa) a v modelovém organismu Dictyostelium během mého druhého plánovaného pobytu na Beatson institutu v Glasgow. Experimentální metody budou zahrnovat (mimo jiné): fluorescenční mikroskopii na živých i fixovaných buňkách, purifikaci proteinů pomocí GST tagů a pomocí GFP Trapů (příprava vzorků na hmotnostní spektrometrii), molekulární klonování a imunotechniky včetně imunofluorescence a Western blotu.
Preliminary scope of work in English
The aim of this doctoral thesis is to improve our undestanding of the WASH complex, a pentameric intracellular complex of the WASP superfamily which regulates Arp2/3 activity. WASH is unique among WASH superfamily protein by localizing to the endosome and regulating the actin polymerization at the vesicular membrane. WASH knock-out cell lines are devoid of all F-actin on endosomal membranes. There are several aspects of the WASH complex that my research will concentrate on, including 1) protein subunit FAM21 and the role of its LFa motifs in recruiting interaction partners, 2) endosomal attachment of the WASH complex and the influence of retromer complex on this, 3) role of enigmatic subunits SWIP and strumpellin and their interaction network and 4) role of other previously pinpointed candidates for interaction partners. The work will be done in human cell lines (U2OS, HeLa) in the home lab at the Faculty of Science and in Dictyostelium during my 2nd planned research internship in Beatson Institute, Glasgow. Experimental methods will include, but will not be limited to, fluorescence live cell and fixed cell microscopy, GST pull-down techniques and GFP Trap technique for mass spectrometry sample preparation, molecular cloning and immunological techniques such as immunofluorescence and Western blot.
