New RNAs that regulate transcription in actinobacteria

• Název práce v češtině: Nové RNA regulující transkripci u aktinobakterií
• Název v anglickém jazyce: New RNAs that regulate transcription in actinobacteria
• Klíčová slova: RNA polymeráza, aktinobakterie, transckripce, RNA, genová exprese
• Klíčová slova anglicky: RNA polymerase, actinobacteria, transcription, RNA, gene expression
• Akademický rok vypsání: 2023/2024
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: Mgr. Jarmila Hnilicová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 17.10.2023
• Datum zadání: 17.10.2023

Zásady pro vypracování

MPGS0034 - Advances in molecular biology and genetics

Předběžná náplň práce

Jedním z klíčových procesů v bakteriální buňce je transkripce prováděná RNA polymerázou (RNAP). RNAP potřebuje k zahájení transkripce sigma faktory. Bakterie navíc exprimují nekódující RNA, které se vážou na RNAP. Dosud byly popsány dvě z těchto RNA – 6S RNA, která se váže na komplex RNAP a primárního sigma faktoru, a Ms1 RNA, která se váže pouze na RNAP. U některých bakteriálních druhů, například u rodu Bifidobacterium nebo Corynebacterium, nebyla objevena ani 6S RNA ani Ms1, což vyvolává otázku, zda je v těchto bakteriích přítomna nějaká podobná RNA nebo zda v bakteriích existují jiné typy RNA vážící sigma faktor nebo RNAP.
Optimalizovali jsme protokol pro RNA imunoprecipitace a sekvenování nové generace (RIP-seq) a našli jsme RNA interagující s RNAP nebo primárním sigma faktorem v Corynebacterium glutamicum. Objevili jsme strukturně odlišnou CoRP RNA (Corynebacterium RNA Polymerase binding RNAs), která váže RNAP. CoRP RNA představuje nový typ regulační RNA vážící se na RNAP.
Doktorand se bude podílet na charakterizaci funkce CoRP RNA. Student pomocí RNA imunoprecipitací stanoví množství komplexu CoRP RNA – RNAP během růstu C. glutamicum. Student také připraví deleční kmen bez CoRP RNA a otestuje vliv CoRP RNA na přežití C. glutamicum v různých stresových podmínkách.
Poté student provede RIP-seq v Bifidobacterium bifidum, aktinobakteriálním druhu, kde dosud nebyla identifikována žádná RNA vážící RNAP. Doktorand ověří interakci potenciálních regulačních RNA s transkripčním aparátem pomocí Northern blotting a RT-qPCR. Student připraví RNA in vitro a ověří vazbu RNA na RNAP nebo primární sigma faktor.
Cílem je popsat různé typy RNAP asociovaných s RNA v bakteriích a odhalit jejich funkci (funkce).
Časový harmonogram:
Rok 1 Validace dat RIP-seq z C. glutamicum, optimalizace podmínek růstu pro B. bifidum a RNA imunoprecipitace
Rok 2 Delece CoRP RNA v C. glutamicum, RIP-seq z B. bifidum
Rok 3 Pull down proteinů interagujících s RNA identifikovanými pomocí RIP-seq v C. glutamicum a B. bifidum (biotinylované RNA budou připraveny in vitro), charakterizace delečního kmene CoRP (růst za stresových podmínek, RNA-seq)
Rok 4 Validace dat RNA-seq z kmene s delecí CoRP, psaní publikací.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

One of the key processes in the bacterial cell is transcription performed by RNA polymerase (RNAP). The RNAP must associate with sigma factors to be able to initiate transcription. In nature, bacteria evolved a unique mechanism how to reversibly sequester and regulate RNAP: they express non-coding RNAs, which bind to the RNAP. Two of them have been described so far – 6S RNA that binds to the complex of RNAP and the primary sigma factor, and Ms1 RNA that binds only to the RNAP. Neither 6S RNA nor Ms1 homologs have been discovered in some bacterial species, for example in Bifidobacterium or Corynebacterium genus, raising a question whether any similar RNA is present in these bacteria or if other types of sigma factor- or RNAP-associated RNAs exist in bacteria.
We have established RNA immunoprecipitation and next generation sequencing (RIP-seq) protocol and identified RNAs interacting with the RNAP or the primary sigma factor in Corynebacterium glutamicum. We found structurally different CoRP RNA (Corynebacterium RNA Polymerase binding RNAs) to bind RNAP. CoRP RNA represents a new type of highly abundant RNAP-regulatory RNA.
PhD student will participate in characterization of CoRP RNA. The student will perform RNA immunoprecipitations to determine the amount of CoRP RNA – RNAP complex during the growth of C. glutamicum. The student will also prepare CoRP RNA deletion strain and test the effect of CoRP RNA on C. glutamicum survival in various stress conditions.
Then, the student will perform RIP-seq in Bifidobacterium bifidum, an actinobacterial specie where no RNAP-associated RNA has been identified yet. PhD student will validate the interaction of potential regulatory RNAs with the transcriptional machinery by Northern blotting and RT-qPCR. The student will prepare RNA in vitro and will confirm the interaction between RNA and RNAP or the primary sigma factor.
The aim is to describe different types RNAP-associated RNAs in bacteria and reveal their function(s).
Time Schedule:
Year 1 Validation of RIP-seq data from C. glutamicum, optimalization of growth conditions for B. bifidum and RNA immunoprecipitation from this species
Year 2 Deletion of CoRP RNA in C. glutamicum, RIP-seq from B. bifidum
Year 3 Reciprocal pull down of proteins interacting with RNAs identified by RIP-seq in C. glutamicum and B. bifidum (RNAs will be in vitro transcribed and biotinylated), characterization of CoRP deletion strain (growth under stress conditions, RNA-seq)
Year 4 Validation of RNA-seq data from CoRP deletion strain,writing publication(s).